Page 85 - 微生物学免疫学进展
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· 8 0 · 微生物学免疫学进展 2016 年 2 月第 44 卷第 1 期 Prog in Microbiol Immunol,Feb. 2016, Vol. 44 No. 1
Tp0117(tprC)、Tp0319(tmpC)、Tp0136、Tp0548 等 Tp 应中每扩增出一条产物就会有一个荧光分子形成,
DNA 的开放编码区。 PCR 属于梅毒诊断常用的高 由此可见,荧光的累积和 PCR 产物的增加是相对应
度特异、敏感的分子生物学方法,可用于检测早期梅 的。 因此,可以通过检测 PCR 荧光值的变化就能准
毒临床各样品中的微量梅毒螺旋体,还可对梅毒螺 确反映扩增产物量的水平。
旋体不同临床株特异性基因进行分型。 目前实验室 目前,FQ-PCR 是以 Tp47 和 polA 作为主要的靶
诊断梅毒常见的 PCR 技术方法主要有常规 PCR、巢 基因设计合成引物,对生殖器溃疡梅毒样品检测,其
式 PCR(Nested PCR)、荧光定量 PCR(Real time flu- 特异性和敏感性均高。 2007 年,Leslie 等 [31] 研究用
orescence quantitative PCR,RTFQ-PCR)、多重 PCR FQ-PCR 以 polA 为靶基因进行扩增,对 301 例早期
(Multiplex PCR, M-PCR) 和 逆 转 录-PCR ( Reverse 梅毒患者检测,通过与血清学方法的比较,结果 FQ-
transcription-PCR,RT-PCR)。 PCR 的特异性为 98. 40% ,敏感性为 80. 39% 。 李佳
3. 1 常规 PCR 利用已知待扩增目的基因序列, 凌等 [32] 基于 TpN17 基因建立的荧光定量 PCR 法检
根据这一序列设计相应的上、下游引物。 已有用 测 血 液 中 梅 毒 螺 旋 体, 能 够 有 效 检 测 血 液 中
PCR 检查梅毒的 Tp0574(tpp47) 和 Tp1016(bmp) 目 10 ~ 10 拷贝 / μL 的梅毒螺旋体,且具有良好的灵
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的基因的报道。 此外,Martin 等 [26] 分别针对 Tp0574 敏性。 另外,FQ-PCR 可直接判定定性定量结果,省
(tpp47)、Tp1016(bmp)、Tp0105(polA)基因从全血和 时省力,并降低了标本污染的可能性。 该法对检测
溃疡分泌物中成功地检测到梅毒螺旋体,而对梅毒 二期梅毒的敏感性弱于一期梅毒,因此,选用 FQ-
螺旋体含量极低、难以去除的 Taq 酶抑制因子的全 PCR 检测 TP-DNA 应 注 意 患 者 的 病 程 及 标 本 的
血/ 血清或 CSF 等标本敏感性极低,一般选用其他 类型 [33] 。
的技术代替。 Rajan 等 [27] 应用 PCR 技术成功扩增 3. 4 多重 PCR (M-PCR) M-PCR 的反应原理、反
了梅毒性葡萄膜炎患者玻璃体液中的梅毒螺旋体 应试剂和操作过程与常规 PCR 相同,是在同一个
Tp0117 ( tprC ), Tp0319 ( tmpC ) 基 因, Tp0136 和 PCR 体系中用多对引物同时扩增几条特异性 DNA
Tp0548 也从一些临床标本中被成功扩增,并表现出 片段的方法。 Orle 等 [34] 有针对性地根据梅毒螺旋
较高的特异性。 Gayet-Ageron 等 [28] 已经证明 Tp- 体(Tp)、单纯疱疹病毒 ( HSV)、杜克雷嗜血杆菌
PCR 可以有效检测早期梅毒病变组织中的梅毒螺 (H. ducreyi)等病原体特异性基因设计相应引物,在
旋体,与 DFM 比,阳性率要高。 同一 PCR 反应体系内同时扩增 Tp47 基因、 HSV
3. 2 巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应,使用两套引 Glycoprotein B 基因、杜克雷嗜血杆菌 16SrRNA 基因,
物扩增特异性的 DNA 片断。 首先用一对外引物进 对生殖器溃疡拭子进行 M-PCR 检测,可以同时检测
行第一轮 PCR,然后再使用外用引物扩增的 DNA 这 3 种病原体,因此,可用于常规实验室的多种疾病
序列内部的一对引物再次扩增。 曾铁兵等 [29] 运用 的筛选诊断。 与其他方法相比,M-PCR 相对省时、
常规及巢式 PCR 扩增了 Tp 的 DNA 多聚酶 I 基因 省力且灵敏性更高,并在设计更多基因靶点时占有
(polA)的特异性片段,对两种方法特异性和灵敏性 一定的优势。
比较研究,结果显示,常规及巢式 polA PCR 均只在 3. 5 逆转录-PCR(RT-PCR) RT-PCR 原理是从组
扩增 Tp Nichols 株时才有特异性的产物,灵敏度各 织或细胞中提取总 RNA,以其中的 mRNA 为模板,
为 40 个/ 100 μL 和 1 个/ 100 μL,认为巢式 PCR 检 利用逆转录酶反转录成互补 DNA,再以此为模板进
测梅毒的敏感性高于常规 PCR。 王佃鹏等 [30] 用巢 行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
式 PCR 检测梅毒螺旋体 DNA,认为该法有助于梅毒 Centurion-Lara 等 [35] 已经扩增出 366 bp 片段的 TP-
的早期诊断与临床治疗。 16S rRNA 基因,对 12 株来自脑汁液、血液及下疳的
3. 3 荧光定量 PCR(FQ-PCR) FQ-PCR 的原理是 梅毒螺旋体分离株进行 RT-PCR 与 TPN47-DNA-
在普通 PCR 体系中加入一段二十几个 bp 的与目的 PCR 结果对比检测,结果显示 RT-PCR 的敏感性优
扩增序列互补荧光探针—寡核苷酸。 随着 PCR 目 于 DNA PCR。 目前 RT-PCR 是以 TP-16S rRNA 作
的基因扩增,Taq 酶的 5'端向 3'端外切酶活性将探 为靶基因设计引物,且用 Southern 印迹杂交试验来
针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 保证其特异性。 因此,操作比较繁琐,不利于在临床
从而能有效检测到报告基团发出的荧光。 PCR 反 中推广使用。
Tp0117(tprC)、Tp0319(tmpC)、Tp0136、Tp0548 等 Tp 应中每扩增出一条产物就会有一个荧光分子形成,
DNA 的开放编码区。 PCR 属于梅毒诊断常用的高 由此可见,荧光的累积和 PCR 产物的增加是相对应
度特异、敏感的分子生物学方法,可用于检测早期梅 的。 因此,可以通过检测 PCR 荧光值的变化就能准
毒临床各样品中的微量梅毒螺旋体,还可对梅毒螺 确反映扩增产物量的水平。
旋体不同临床株特异性基因进行分型。 目前实验室 目前,FQ-PCR 是以 Tp47 和 polA 作为主要的靶
诊断梅毒常见的 PCR 技术方法主要有常规 PCR、巢 基因设计合成引物,对生殖器溃疡梅毒样品检测,其
式 PCR(Nested PCR)、荧光定量 PCR(Real time flu- 特异性和敏感性均高。 2007 年,Leslie 等 [31] 研究用
orescence quantitative PCR,RTFQ-PCR)、多重 PCR FQ-PCR 以 polA 为靶基因进行扩增,对 301 例早期
(Multiplex PCR, M-PCR) 和 逆 转 录-PCR ( Reverse 梅毒患者检测,通过与血清学方法的比较,结果 FQ-
transcription-PCR,RT-PCR)。 PCR 的特异性为 98. 40% ,敏感性为 80. 39% 。 李佳
3. 1 常规 PCR 利用已知待扩增目的基因序列, 凌等 [32] 基于 TpN17 基因建立的荧光定量 PCR 法检
根据这一序列设计相应的上、下游引物。 已有用 测 血 液 中 梅 毒 螺 旋 体, 能 够 有 效 检 测 血 液 中
PCR 检查梅毒的 Tp0574(tpp47) 和 Tp1016(bmp) 目 10 ~ 10 拷贝 / μL 的梅毒螺旋体,且具有良好的灵
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的基因的报道。 此外,Martin 等 [26] 分别针对 Tp0574 敏性。 另外,FQ-PCR 可直接判定定性定量结果,省
(tpp47)、Tp1016(bmp)、Tp0105(polA)基因从全血和 时省力,并降低了标本污染的可能性。 该法对检测
溃疡分泌物中成功地检测到梅毒螺旋体,而对梅毒 二期梅毒的敏感性弱于一期梅毒,因此,选用 FQ-
螺旋体含量极低、难以去除的 Taq 酶抑制因子的全 PCR 检测 TP-DNA 应 注 意 患 者 的 病 程 及 标 本 的
血/ 血清或 CSF 等标本敏感性极低,一般选用其他 类型 [33] 。
的技术代替。 Rajan 等 [27] 应用 PCR 技术成功扩增 3. 4 多重 PCR (M-PCR) M-PCR 的反应原理、反
了梅毒性葡萄膜炎患者玻璃体液中的梅毒螺旋体 应试剂和操作过程与常规 PCR 相同,是在同一个
Tp0117 ( tprC ), Tp0319 ( tmpC ) 基 因, Tp0136 和 PCR 体系中用多对引物同时扩增几条特异性 DNA
Tp0548 也从一些临床标本中被成功扩增,并表现出 片段的方法。 Orle 等 [34] 有针对性地根据梅毒螺旋
较高的特异性。 Gayet-Ageron 等 [28] 已经证明 Tp- 体(Tp)、单纯疱疹病毒 ( HSV)、杜克雷嗜血杆菌
PCR 可以有效检测早期梅毒病变组织中的梅毒螺 (H. ducreyi)等病原体特异性基因设计相应引物,在
旋体,与 DFM 比,阳性率要高。 同一 PCR 反应体系内同时扩增 Tp47 基因、 HSV
3. 2 巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应,使用两套引 Glycoprotein B 基因、杜克雷嗜血杆菌 16SrRNA 基因,
物扩增特异性的 DNA 片断。 首先用一对外引物进 对生殖器溃疡拭子进行 M-PCR 检测,可以同时检测
行第一轮 PCR,然后再使用外用引物扩增的 DNA 这 3 种病原体,因此,可用于常规实验室的多种疾病
序列内部的一对引物再次扩增。 曾铁兵等 [29] 运用 的筛选诊断。 与其他方法相比,M-PCR 相对省时、
常规及巢式 PCR 扩增了 Tp 的 DNA 多聚酶 I 基因 省力且灵敏性更高,并在设计更多基因靶点时占有
(polA)的特异性片段,对两种方法特异性和灵敏性 一定的优势。
比较研究,结果显示,常规及巢式 polA PCR 均只在 3. 5 逆转录-PCR(RT-PCR) RT-PCR 原理是从组
扩增 Tp Nichols 株时才有特异性的产物,灵敏度各 织或细胞中提取总 RNA,以其中的 mRNA 为模板,
为 40 个/ 100 μL 和 1 个/ 100 μL,认为巢式 PCR 检 利用逆转录酶反转录成互补 DNA,再以此为模板进
测梅毒的敏感性高于常规 PCR。 王佃鹏等 [30] 用巢 行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
式 PCR 检测梅毒螺旋体 DNA,认为该法有助于梅毒 Centurion-Lara 等 [35] 已经扩增出 366 bp 片段的 TP-
的早期诊断与临床治疗。 16S rRNA 基因,对 12 株来自脑汁液、血液及下疳的
3. 3 荧光定量 PCR(FQ-PCR) FQ-PCR 的原理是 梅毒螺旋体分离株进行 RT-PCR 与 TPN47-DNA-
在普通 PCR 体系中加入一段二十几个 bp 的与目的 PCR 结果对比检测,结果显示 RT-PCR 的敏感性优
扩增序列互补荧光探针—寡核苷酸。 随着 PCR 目 于 DNA PCR。 目前 RT-PCR 是以 TP-16S rRNA 作
的基因扩增,Taq 酶的 5'端向 3'端外切酶活性将探 为靶基因设计引物,且用 Southern 印迹杂交试验来
针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 保证其特异性。 因此,操作比较繁琐,不利于在临床
从而能有效检测到报告基团发出的荧光。 PCR 反 中推广使用。
